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  • 含羞草素對肝癌細胞QGY-7703周期同步化的作用

    2017-01-02 09:00:00   來源:本站   作者:本站    瀏覽人數:

    含羞草素對肝癌細胞QGY-7703周期同步化的作用

    趙雪芹1,任磊2,王大巾1,張永明1,陶斯杰1

    (1.浙江理工大學生命科學院,杭州310018;2.廈門大學材料學院,福建廈門361005)

    摘要:惡性腫瘤是嚴重威脅人類健康的疾病之一。腫瘤的發生發展本質上就是細胞無限制的周期性生長、增殖和分化的失調。細胞同步化是研究腫瘤發生發展及治療的基礎。實驗以人肝癌QGY-7703細胞株為研究對象,考察含羞草素阻斷對周期同步化的作用。并與胸腺嘧啶脫氧核苷阻斷法相對照,研究含羞草素阻斷去除后對QGY-7703細胞周期的影響。結果顯示:QGY-7703細胞在含羞草素阻斷后釋放的第10h進入S期,第20h進入G2/M期,且最高同步率分別為G1期94.6%,S期86.0%。含羞草素能較好地使肝癌細胞株QGY-7703同步化于G1期和S期。

    關鍵詞:含羞草素;肝癌細胞;細胞周期;同步化

    中圖分類號:TS195.644  文獻標志碼:A  文章編號:1673-3851201604-0620-05  

     

    Cyecle Synchronization of Human Hepatoma Cell QGY-7703 Induced by L-mimosine

    Zhao Xueqin1,Ren Lei2,Wang Dajin1,Zhang Yongming1,Tao Sijie1

    1.College of Life Sciences,Zhejiang Sci-Tech University,Hangzhou 310018,China;2.College of Materials,Xiamen University,Xiamen 361005,China

    [Abstract]Cancer is one of diseases which severely threaten human health.In essence,tumorigenesis and tumor progression result from a disorder of unlimited periodic growth,proliferation and differentiation of cells.Cell synchronization is the foundation of researches on tumorigenesis,tumor progression and treatment.Here,we investigated the effect of L-mimosine blocking on cycle synchronization by taking human.hepatoma cell QGY-7703.Furthermore,compared with thymidine blocking,the effect of Lmimosine blocking removal on cell cycle of QGY-7703cells was investigated.The results show that QGY-7703cells enter Sphase at the 10th hour and enter G2/M phase at the 20th hour after release from the L-mimosine.The highest synchronization rate is 94.6 in G1 phase and 86.0 in S phase cells.In conclusion,QGY-7703cell can be successfully synchronized in G1phase and S phase by the L-mimosine treatment.

    [Key words]L-mimosine;human hepatoma cell;cell cycle;synchronization

     

    肝癌是全球最常見的五種惡性腫瘤之一。我國原發性肝 癌 發 病 人 數 占 全 球 的 55%,死 亡 人 數 占45%。雖然目前以外科手術、放療、化療為主的肝癌基本治療手段取得了一定發展,但由于腫瘤細胞對化、放療耐受等問題,其療效甚微。研究發現,腫瘤組織中生長著不同周期時相的腫瘤細胞。絕大多數化療藥物與放療手段對腫瘤細胞的殺傷作用依賴于細胞周期特異性。喜樹堿、絲裂霉素、氮芥、氟脲嘧啶為 S期特異性[1-3],而長春新堿、泰素和放療具有G2/M 期特異性[4]。如何安排放、化療的時程,最大化治療效果,仍是臨床上有待解決的問題。

    細胞同步化是研究腫瘤發生發展及治療的基礎。同步化后再使用放療或化療藥物作用于腫瘤,能夠起到協同增效作用。沙利度胺能夠增強 X 射線對膠質瘤 U251細胞敏感性[5]。姜黃色素顯著提高人前列腺癌、胃癌細胞株 SGC-7901與直腸癌的放療敏感性[6-8]。曲智鋒等[9]利用多西他賽聯合奧沙利鉑同步化放療局部晚期非小細胞肺癌,提高了臨床治療效果。此外,王雪卿等[10]發現同步化能加強紫杉醇對腫瘤細胞的作用效果以及逆轉 其耐藥性。故此,利用同步化試劑,合理安排放療、化療的時程,能達到最佳治療效果。

    含羞草素(L-mimosine)是從含羞草或銀合歡中提煉的植物氨基酸。它具有與胸腺嘧啶高度相似的化學結構,可競爭性地與腺嘌呤結合[11-12],從而阻礙 DNA的合成,使細胞阻滯在 G1/S點。研究表明含羞草素能將PC-3 細 胞 阻 滯 在 G1 期,LNCaP 細 胞 阻 滯 在 S期[13]。同時,含羞草能夠抑制 K562,7402等多種腫瘤細胞生長,并可其誘導凋亡[14-15]。鑒于此,本研究以含羞草素作為 DNA 合成抑制劑,從細胞周期角度出發,探討肝癌細胞 QGY-7703對含羞草素的敏感性,并對比胸腺嘧啶脫氧核苷(簡稱胸苷)阻斷法,研究含羞草素阻斷去除后對 QGY-7703細胞周期的影響。

     

    1   材料與方法

    1.1  實驗材料與設備  RPMI-1640培養基、胎 清、雙 為美國 Hyclone 品。含 L-mimosine,AR)購于美國 Acros Organic公司。胸腺嘧啶脫氧核苷(TdR,AR)、碘化丙啶(PI,AR),曲拉通 X-100Triton X-100,AR)和胰核糖核酸酶(RnaseA)為美國Sigma公司 品。流 BD FACSVantage SE型產品。QGY-7703細胞株為本室保存的,來源于上海細胞庫的細胞。

    1.2  試驗方法

    1.2.1 細胞培養  將肝 癌 細 胞 株 QGY-7703 接 種 于 RPMI-1640培養基(含100U/mL青霉素,100U/mL 鏈霉素和10%胎牛血清)。于37 ℃,5% CO2的恒溫培養箱中進行培養。48~72h傳代1次。

    1.2.2  細胞同步化方法  a)含羞草素阻斷法:用含300μM 含羞草素的培養液培養24h,棄去培養液,PBS清洗2次除去殘余藥物,換正常培養基繼續培養若干小時,以流式細胞術(FCM)檢測藥物去除后細胞的同步化程度。b)胸苷單阻斷法:加入含2mM 胸苷的1640培養液處理24h后,除去培養液,PBS清洗數次,再將細胞放在含有10%小牛血清的1640培養液中繼續培養設定時間。每隔2h收集細胞。收集的細胞用 PBS洗滌后以預冷的70%乙醇固定細胞,放置于4℃冰箱過夜。

    1.2.3  細胞周期檢測  用 FCM 檢 測 QGY-7703 細 胞 不 同 時 相 的DNA 含量。向收集的各組樣本中,加入2mL 預冷的70%乙醇固定細胞過夜。檢測前,離心去乙醇,PBS清洗后加入0.5 mL 碘化丙啶染料(50μg/mLPI,100μg/mL RNaseA,0.2% Trixon-100),室溫避光染 色 30 min,收 集 碘 化 丙 啶 熒 光 信 號。使 用CellQuest軟件分析細胞各周期時相比率。

     

    2   結果分析

    2.1  含羞草素作用后細胞同步化結果  本實驗將含羞草素作用于人肝癌 QGY-7703細胞株,研究其對 QGY-7703細胞株的同步化作用效果。以FCM 檢測 DNA熒光標識細胞各時相的變化。單次含羞草素阻斷后各時點的流式圖見圖 1。從圖1可看出:含羞草素同步化處理后的絕大部分細胞被阻斷在預期的時相,而未加藥物處理的對照組細胞中處于預期時相的細胞比例較低,大多數處于非同步化生長狀態。又由圖1(a)知,未同步化的 QGY-7703細胞各時相分別為 G1期占65.8%,S期占20.7%,G2/M 期占12.7%。通過計算可得出:細胞 G1期時長為13.2h,S期為4.1h,G2/M 期為2.5h。

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    1 含羞草素作用 QGY-7703細胞后不同時點的流式周期分布

    為了便于觀察各周期時相的變化規律,將多次同步化結果匯總成圖2??砂l現:含羞草素處理細胞24h后,各周期時相所占的百分率依次由少量向高峰過渡。在含羞草素作用結束后的第 0h,G1 期與 S 期細胞比率占到總數的 90%,這說明 大 多 數QGY-7703細胞被阻斷在 G1期末(圖1(b));繼續培養8h后,G1 期細胞逐漸減少,S 期細胞逐漸增多,第8h 細胞 G1 期達到最大值,為 96.4%(圖 1(c)),且在第 0~10h 內保持 80% 以上同步率;第20h細胞S期達到最大值為82.9%;隨后 G2/M 期細胞逐漸增加。這表明含羞草素能夠可逆的作用于QGY-7703細胞,并 可 獲 得 同 步 化 效 果 較 好 的 G1期和S期細胞。此外,由含羞草素處理后的 G1 期曲線可發現,G1期最高值94.6%與最低值7.9%分別出現在去除藥物后的第8h和第20h,相差12h,與未同步化的 G1期時長(13.2h)相似。并且,各曲線在20h處,均出現拐點,推測含羞草素基本不影響 QGY-7703細胞周期總時長。

     

    基礎-002.jpg

    圖2 含羞草素阻斷后細胞周期分布

    基礎-003.jpg

    圖3 胸腺嘧啶脫氧核苷阻斷細胞周期分布

     

    2.2  胸苷作用后細胞同步化結果  胸苷是 DNA 的特異前體,氚標記胸苷滲入法是目前常用的細胞增殖檢測方法。故此,本研究采用胸苷阻斷后 QGY-7703細胞各時相的變化 來 對比研究含羞草素的作用效果。胸苷處理后(圖3),在前8h內 G1期細胞逐漸減少,S期細胞逐漸增多,第8h 細胞 G1期達到最小值29.0%,S 期達到最大值 75.7%;隨后 G2/M期細胞逐漸增加,第10h細胞 G2/M 期達到最大值為41.9%。此外,細胞 G1期的兩個峰值分別為2h的52.2%和22h的87.2%,兩峰值間隔20h,表明實驗條件下該細胞周期約為20h。G2/M 期曲線8~12h出現峰,推測 G2/M 期時長4h。S期曲線2~10h出現峰,推測 S期時長8h。與按空白細胞推測的各期時間長度不同(圖1a),可能是細胞種植密度過大,接觸抑制造成 G1期延長。含羞草素與胸苷都是通過調控細胞 G1/S時點將細胞阻滯于 G1期末,但由圖3、圖2中的 G1期曲線可發現:胸苷組在第2h開始減少(圖3,G1期2h處);而含羞草素處理的在第 8h 開始減少(圖2,G1期8h處),相較于胸苷組延后6h。同樣,對比兩種藥物處理組的S期曲線,可發現:胸苷組在第8h開始減少(圖3,S期8h處);而含羞草素處理的在第20h開始減少(圖2,G1期20h處),相較于胸苷組延后 12h。則含 羞 草素使 QGY-7703 細胞 S期延后6h。Park 等[16]發現含羞草素可使人宮頸癌 Hela細胞株的S早期延后4h。故此推測,本實驗條件下 QGY-7703細胞對含羞草素的作用敏感,用藥后細胞進入正常周期的時間延后 6h,且 S 早期也延后6h。

     

    3   討論

    腫瘤的發生發展本質上是細胞周期的失調。大部分抗腫瘤藥物具有細胞周期特異性。同步化是研究細胞周期調控與藥物特異性作用最重要的方法。

    細胞分裂是細胞最基本的生理活動。細胞周期的運行遵循著嚴格的時相次序。體外培養細胞根據細胞來源不同選用不同阻斷方法是細胞停止在細胞周期的某一時相。目前報道的主要有血清饑餓、藥物抑制、低溫、照射、機械振動收集分裂細胞等[17]。其中,藥物阻斷法是體外培養細胞人工同步化最常用的方法。該阻斷法要求對細胞周期的阻斷是可逆的,即去除藥物加入培養基后細胞仍可正常生長。

    目前應用最多的合成抑制劑是胸苷[16-17]。白瑞霞等[18]通過胸苷阻斷人肝癌細胞株 HepG2獲得了同步率60%以上的 G1期和 G2期。胸苷阻斷法的優點是細胞同步化效率高,且適用于任何體外培養的細胞體系,缺點是容易造成細胞的不均等生長。含羞草素與胸腺嘧啶具有高度相似性化學結構,可競爭性地與腺嘌呤結合,將細胞同步于 G1晚期,并且研究表明含羞草素對多種腫瘤細胞有抑制作用,可作為放射增敏劑增加對腫瘤的療效[19-22]。

    本實驗條件下,含羞草素不僅能同步肝癌細胞 QGY-7703,而且獲得的高 G1期同步率(80%以上)能夠持續10h,這將便于應用于耗時較長的生物物理方面的研究。

     

    4   結 論

    aQGY-7703細胞在阻斷結束后第 010h G1期的同步率均維持在 80 以上,第 10h 進入 S期,第20h進入 G2/M 期。

    b)可實現的 G1、S期最高同步率分別為94.6%和86.0%。且同步率穩定可靠。

    c)含 QGY-7703 G1 阻滯,并可使S期延后6h。

     

    參考文獻

    [1]GORCZYCA W,GONG J,ARDELT B,et al.The cell cycle related differences in susceptibility of HL-60cells to apoptosis induced by various antitumor agents[J].Cancer Research,1993,53(13):3186-3192.

    [2]羅賢雯,劉仁剛,周潔萍,.高溫阻滯 HeLa細胞于 G1期并引起 G1期細胞凋亡[J].華中科技大學學報:醫學版,2005,34(1):17-19.

    [3]王昱,盧仲毅,許峰,.羥基脲對體外 Hela細胞周期同步化作用的研究[J].重慶醫學,2010,39:3331-3332.

    [4]張鵬.化療藥物細胞周期特異性的重新評估[D].武漢:華中科技大學,2006.

    [5]于靜萍,孫美玲,孫蘇平,.沙利度胺增強 X <span style="font-family:

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